了解白癜风黑素细胞的消失与角朊细胞产生的内皮素

　　了解白癜风黑素细胞的消失与角朊细胞产生的内皮素-1(ET-1)水平的关系。方法采用原位杂交的方法检测了14例进展期寻常型白癜风患者表皮角朊细胞ET-1mRNA表达。结果白癜风患者白斑区及白斑边缘角朊细胞ET-1mRNA表达明显降低。结论白癜风的发生可能与角朊细胞所分泌的ET-1等生长因子缺乏有关，角朊细胞ET-1表达水平降低的原因以及在白癜风发病中作用尚需进一步研究。

　　一、标本来源及制作

　　白癜风患者组：共14例，均为临床诊断明确的进展期寻常型白癜风患者(诊断根据全国色素病学组制定的诊断标准)。其中男10例，女4例；年龄18～56岁；病程3个月至20年；其中散发型12例，泛发型2例。所有患者近1个月内未接受皮质类固醇激素、免疫抑制剂、紫外线、光敏药物治疗，也未接受其它系统药物治疗；正常对照组：共8例，其中男女各4例，年龄18～61岁。所有皮肤标本均取于胸腹部，常规手术活检取材。白癜风组中，其中4例在白斑区、白斑边缘(白斑向外2～5mm白斑向正常皮肤移行处)取材，10例在白斑区、白斑边缘、白斑对侧且至少远离白斑10cm处正常皮肤处活检取材。正常人皮肤标本取自于胸腹部手术切口处。皮肤组织取下后立即置于10%的中性福尔马林溶液中固定24小时，脱水，石蜡包埋。切片厚为5μm，覆于涂有Apes的载玻片上，置于65℃的烤箱中烤片40分钟。

　　二、ET-1RNA探针的制备

　　ET-1重组质粒由北京医科大学病理学系分子病理实验室提供。ET-1片段为1.1kb。将重组质粒转染大肠杆菌，进行质粒扩增，然后碱变性法提取质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ将质粒DNA线性化。在T７RNA聚合酶作用下体外转录合成地高辛标记的反义RNA探针，在SP６RNA聚合酶的作用下合成正义探针。

　　三、原位杂交

　　具体步骤如下：切片于二甲苯中脱蜡1小时，3次，然后于100%、90%、85%乙醇中水化，PBS清洗。切片组织上滴加0.1NHCl，室温下10分钟，然后PBS冲洗。组织在37℃用100μg/ml的蛋白酶K消化10分钟。PBS冲洗后，室温下吹干。滴加杂交液。在Ep管中每张切片加入下列成分：ET-1RNA探针2μl，去离子甲酰胺10μl，SSD1μl，50×Denhardts2μl，硫酸葡聚糖2μl，1mol/LDTT1μl，20×SSC4μl，上述成分混匀后于80℃～90℃水浴中放置5分钟，然后滴于切片组织上，每张切片滴加20μl。切片置于盛有甲酰胺的湿盒中，42℃杂交16～20小时。杂交后2×SSC浸洗15分钟，2次，然后用1∶1000RNase室温下消化5分钟。1×SSC浸洗15分钟，2次后，地高辛缓冲液Ⅰ浸洗5分钟。用地高辛缓冲液Ⅰ1∶100稀释的马血清37℃封闭30分钟。加用地高辛缓冲液Ⅰ1∶500稀释的地高辛抗体，37℃，30分钟。用地高辛缓冲液Ⅰ浸洗15分钟，2次后，用地高辛缓冲液Ⅲ浸洗3分钟，2次。滴加用地高辛缓冲液Ⅲ1∶100稀释的BCIP/NBT，避光显色15～30分钟。终止显色，二甲苯透明，封片。阳性结果判定：胞浆中出现蓝紫色信号为染色阳性。正义探针作阴性对照。

　　四、图像分析及统计学处理

　　采用MPI-400计算机多媒体彩色图文分析系统(同济太阳公司)对切片上的染色信号进行灰度分析。每个切片组织随机选取3个视野，测量单位面积平均灰度值。灰度值代表信号表达强度。各组之间平均灰度值差别采用方差分析。

　　结果

　　光镜下观察：白癜风患者白斑区、白斑边缘角朊细胞与白斑对侧皮肤角朊细胞(图1)及正常人皮肤角朊细胞(图2)比较，白斑区、白斑边缘角朊细胞ET-1mRNA表达明显降低。白斑区与白斑边缘角朊细胞比较，白斑区角朊细胞ET-1mRNA表达低。白斑对侧皮肤角朊细胞与正常人皮肤角朊细胞ET-1mRNA表达未见差别。